多抗親和層析純化
多抗的純化是一件比較簡單的事情，因為人工干預(yù)比較大，所以對實(shí)驗者的操作依賴性較強(qiáng)。很多新手覺得這是一件比較復(fù)雜困難的工作，但是如果理解了原理，就可以自行改進(jìn)實(shí)驗了。多抗純化方法比較多，過去有用鹽析法純化的，有用辛酸-硫酸銨沉淀的方式純化的，也有用冷酒精沉淀的方式純化的，也有后來的離子交換層析和Protein A、G、A/G 純化的，但是在今天，市場上幾乎所有的抗體都是通過抗原親和純化得到的，與其它方法相比，抗原親和層析得到的抗體效率高、產(chǎn)量高、產(chǎn)品純、操作簡單。鑒于很多網(wǎng)友問起這方面的問題，我就詳細(xì)地講一講親和純化原理和操作。
說到親和層析，還得從上個世紀(jì)60年代說起。當(dāng)年美國NIH（National Institutes of Health）
有個學(xué)生在研究一種酶和抑制劑之間的相互作用的時候，突發(fā)奇想：既然此酶可以和抑制劑結(jié)合，那如果把抑制劑固定起來，不就可以用來純化酶了嗎？試了一下覺得果然可行于是發(fā)了論文，從那之后，就出現(xiàn)了各種各樣的親和層析，親和配基與配體可以是酶與底物、酶與抑制劑、激素與受體、抗原和抗體、糖蛋白與凝集素、生物素與親和素、組氨酸與二價金屬離子、卟啉環(huán)與亞鐵離子等。親和層析精髓：將一種分子固定，用來吸附另一種特異性分子，最后將其洗脫下來。
言規(guī)正傳，多抗的親和層析是基于抗原與抗體結(jié)合的一種層析方式?；舅悸肥菍⒖乖潭ㄔ谝环N基質(zhì)（也就是柱的填料，大家都叫介質(zhì)或beads）上，然后與抗血清孵育以捕獲相應(yīng)的抗體，然后從基質(zhì)上洗掉非特異性結(jié)合的抗體，最后再將抗體洗脫下來。一個經(jīng)典的親和純化流程如下：
（1）介質(zhì)的制備目前大部分親和柱介質(zhì)都是基于瓊脂糖（Agarose）或者葡聚糖(Dextran)。由于瓊脂糖穩(wěn)定性好、對蛋白質(zhì)的非特異性吸附低、適宜活化，因此是制備抗原親和柱介質(zhì)的理想材料。單純的瓊脂糖是不能和蛋白質(zhì)直接相連的，因此需要給它加一個有活性的臂，這就有點(diǎn)類似多肽與載體蛋白的偶聯(lián)需要一個雙功能試劑一樣。瓊脂糖加臂（活化）的方法比較多，其中涉及的原理也和多肽與載體蛋白偶聯(lián)類似，最常用的活化試劑是溴化氰和環(huán)氧氯丙烷，另外二溴丙醇、N,N'-羰基二咪唑、雙環(huán)氧化物等也可以用來活化瓊脂
糖。
溴化氰對瓊脂糖的活化機(jī)理如下：
環(huán)氧氯丙烷活化機(jī)理如下：
關(guān)于如何操作的問題，可以參考文獻(xiàn)。如果你想自己制備，為了你和他人的安全，請不要使用溴化氰活化，溴化氰有劇毒，極微量的攝入都有可能造成死亡，本人對此類事故不負(fù)任何責(zé)任。如果是單純做一次或幾次小量抗原親和純化，建議購買商品化的介質(zhì)，GE Healthcare 就有賣的（Cat. NO.為17-0430-01）。以下的介紹就基于此介質(zhì)說明書展開敘述的。使用此種介質(zhì)首先需要將其進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理方法是：稱取適量的介質(zhì)（一般0.5g介質(zhì)可以一次性純化10ml 左右血清，可以反復(fù)使用）倒入pH 2.0 HCl 中，4℃讓其吸脹15min，體積膨脹比例為：1g 可以膨脹至3.5ml，然后將其裝入漏斗中，用pH2.0 HCl 充分洗滌（體積為介質(zhì)膨脹后的50倍以上）以除去保護(hù)劑。千萬不可用中性或堿性試劑洗滌，否則介質(zhì)會水解。
（2）抗原與介質(zhì)的連接這一步是整個純化過程中最關(guān)鍵的一步，如果在這一步上有什么失誤，建議你從第一步重新開始吧。首先要注意一點(diǎn)：常見的連接方法都基于抗原上的游離氨基或者巰基與活化后的介質(zhì)的連接，因此體系中不應(yīng)該有其它含有氨基或巰基的化合物，包括尿素、硫脲、鹽酸胍、Tris、銨根離子、β-巰基乙醇等，如果有這些物質(zhì)在體系中，應(yīng)該首先設(shè)法除去。
溴化氰活化的瓊脂糖與氨基化合物反應(yīng)的機(jī)理如下：
環(huán)氧氯丙烷活化的瓊脂糖與氨基化合物反應(yīng)的機(jī)理如下：
連接反應(yīng)進(jìn)行的條件：① 緩沖體系。上述兩個連接反應(yīng)都應(yīng)該在堿性環(huán)境下進(jìn)行。pH宜在8-10之間，推薦使用Na2CO3-NaHCO3體系，pH 盡量偏離蛋白的等電點(diǎn)，但不可高于10，否則介質(zhì)很容易水解。pH 也不能過低，否則抗原的氨基或巰基會被質(zhì)子化，無法與介質(zhì)結(jié)合。也可以考慮用其它的緩沖體系，但是絕對不可引入帶有游離氨基或者巰基的化合物。為了防止蛋白類抗原的聚集，體系中還可以加入0.5M NaCl 以提高鹽離子濃度。② 蛋白質(zhì)濃度。為了達(dá)到比較快而且比較徹底的反應(yīng)，抗原濃度應(yīng)盡量提高（也就是高中課本上講的勒沙特列原理），但過高的濃度有可能造成聚集形成沉淀。一般推薦濃度是5-10mg/ml。需要注意的是介質(zhì)的承載量并沒有這么大。用來連接的蛋白在緩沖體系中必須完全溶解，如果不能溶解可以嘗試加入去垢劑，多肽等小分子化合物可以用DMSO、DMF、二氧六環(huán)助溶。③ 反應(yīng)溫度與時間。此反應(yīng)可以在室溫進(jìn)行，一般來說，室溫4小時反應(yīng)足夠完成，如果擔(dān)心抗原降解，可以在4℃進(jìn)行，需要過夜反應(yīng)。
（3）連接效果的評估有經(jīng)驗的同仁這一步基本可以不做，但是對于新手來說做了這一步心里更有譜一些。這個過程盡量用比較簡單的實(shí)驗來做比較好，推薦使用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford 法），但是體系中如果含有去垢劑，建議改用其它的方法（如BCA、Lowery、凱氏定氮法等），也可以取連接后的上清液（離心后）拿去做SDS-PAGE 判斷。確認(rèn)連接沒有問題后，以將體系轉(zhuǎn)入柱子里除去連接后的液體，如果沒有柱子，也可以用離心的方法進(jìn)行，下同。
（4）多余位點(diǎn)的封閉為了保證連接效率，介質(zhì)的量通常是過量的，因此連接完后，介質(zhì)上就有很多多余的空位點(diǎn)，如果不把它們封閉，那接下來的一步里就會與血清中的抗體結(jié)合，這樣就會影響抗體得率。含有氨基的小分子化合物都可以用來進(jìn)行封閉，如尿素、Tris、乙醇氨、單一氨基酸等，大分子物質(zhì)是不適宜用來封閉的，因為它們的空間位阻會影響下一步中抗體與抗原的結(jié)合。封閉條件與連接條件基本類似。封閉完成后，除去封閉液，用PBS洗柱三次。
（5）抗血清與介質(zhì)的結(jié)合血清事先經(jīng)過10000g 離心5min，有條件的還可以通過0.45μm濾膜過濾。將血清用PBS 稀釋一倍，然后加入連好抗原的介質(zhì)，密封好，4℃搖晃過液或者室溫?fù)u晃3至4小時，搖晃時最好能顛倒來回?fù)u動，確保所有介質(zhì)都能懸在液體中。室溫孵育時間不宜過長，否則會引起非特異性吸附，同時影響抗體質(zhì)量。
（6）非特異性結(jié)合的抗體的洗滌第5步完成后，過柱或者離心去掉血清成份，用PBS洗滌三次。然后再用一個稍稍Harsh 一點(diǎn)的體系去洗掉與抗原非特異性結(jié)合的蛋白，怎么樣的體系算是比較Harsh 呢？ 一種是偏酸或偏堿一點(diǎn)的pH，可以加酸或加堿將PBS 或生理鹽水的pH 調(diào)至偏酸（5.0）或偏堿（8.5）作為洗滌液，用10倍柱體積洗柱一次，也可以直接用150mM Gly，基本不用調(diào)pH 就是pH=5.0了。另一種體系是高鹽離子濃度，例如可以在PBS 里加入NaCl 至終濃度為1M，10倍柱體積洗滌一次。兩種體系的本質(zhì)都是減弱蛋白質(zhì)分子間的作用力。
（7）洗脫經(jīng)過第6步的操作后，結(jié)合在柱上的抗體就非常純了，同時那些親和力弱的抗體也被洗掉，于是可以開始洗脫了。洗脫方法和上面的洗滌原理基本類似，只是條件更苛刻一點(diǎn)。通常用得比較多的辦法是用pH 2.5左右的HCl（含150mM NaCl）洗脫，也可以采用堿性洗脫液洗脫。洗脫有兩種方式，一種是連續(xù)洗脫，另一種是不連續(xù)洗脫。前者是連續(xù)入加洗脫液，即時監(jiān)控洗脫情況并隨時決定收集目的抗體組分。不連續(xù)洗脫則是分批加入洗脫液，分批收集洗脫流出的成份，最后再對每一次收集的組分檢測。如果用前一種方法，最好有一臺紫外監(jiān)測儀檢測流出組分以便即時監(jiān)控，后一種方法的檢測則相對比較簡單一些，只要是可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量的方法都可以使用（如Bradford 法、Lowery 法、BCA 法等都可以），總之就是越簡單越好。洗脫過程盡里在低溫完成，洗脫下的組分應(yīng)該在冰盒上放置，洗脫下來后的成份應(yīng)該立即調(diào)節(jié)pH 至中性，調(diào)節(jié)pH 應(yīng)該使用緩沖液，而不應(yīng)該直接使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿，Na2HPO4、Na2CO3和Tris 等緩沖液是用來作為中和液的不錯選擇。需要指出的是，如果需要將抗體進(jìn)行偶聯(lián)熒光素或者酶的時候，就不能使用Tris 作為中和液，否則會影響后面的邊接效率。
（8）抗體的保存抗體純化完后，必須采取合適的保存，否則很容易就失去活性?？偟膩碚f有這么幾個方面需要注意：① 緩沖體系。純化后的抗體必須處于一個相對接近體液的緩沖體系中，一般的PBS 體系就足夠了。注意不要引入高濃度的離子，尤其是金屬離子。不要引入干擾抗體實(shí)驗的離子或基團(tuán)。② 防腐劑。為了防止抗體長菌，必須加入防腐劑，常見的防腐劑有：疊氮鈉、硫柳汞、抗生素（慶大霉素）。疊氮鈉的常用濃度是0.02%，硫柳汞和慶大霉素的常用濃度為0.01%，其中疊氮鈉會抑制HRP 酶活性，因此在需要偶聯(lián)HRP酶的抗體中不能加這種防腐劑，而且疊氮鈉會影響細(xì)胞色素氧化酶活性，會干擾機(jī)體的呼吸作用，因此操作時需要注意安全。硫柳汞對兒童具有潛在毒性，使用時也應(yīng)注意。③ 穩(wěn)定劑。向抗體中加入穩(wěn)定劑可以增加其穩(wěn)定性，常見的穩(wěn)定劑有多羥基類化合物（二元醇、三元醇等，如濃度為30%-50%的甘油、乙二醇）、二糖類物質(zhì)（如蔗糖、海藻糖等）、氨基酸、蛋白質(zhì)（如BSA 等），如果抗體需要進(jìn)行標(biāo)記，則不可以加入氨基酸、BSA 等保護(hù)劑。④溫度。長期不用時，抗體應(yīng)該低溫保存，一般采用-20℃保存。短期不用可以放在4℃，但不要超過一周?？贵w絕對要避免反復(fù)凍融，前面提到的加入甘油等既可以起穩(wěn)定作用，還可以起防凍的作用。如果有條件，可以把抗體進(jìn)行冷凍干燥形成凍干粉，放在-80℃。如果抗體尚未純化，直接以血清的方式保存在-20℃以下，也可以很好地保證其活性。⑤ 濃度。和普通蛋白質(zhì)一樣，濃度越高就越利于保存。如果抗體濃度太低，可以采用超濾、protein A 或Protein G（操作方法參考單抗純化相關(guān)介紹）、透析袋等方式濃縮。超濾的方式操作簡單，直接將抗體裝入超濾管再進(jìn)行離心即可。透析袋濃縮操作也比較簡單，將PEG（分子量大于8000）配成50%左右的溶液，用合適孔徑的透析袋裝好抗體，然后放入PEG 溶液中攪拌濃縮即可。關(guān)于Protein A 或Protein G 濃縮的方法將在單抗純化相關(guān)部分講述，需要指出的是這用這兩種親和柱濃縮的損失可能比較大。⑥ 存儲時間?？贵w在-20℃并含有甘油的情況下可以存放數(shù)年至十幾年（不要反復(fù)拿至溫室）。在4℃存放的時間一般在一個月左右就可以有明顯的效價變化。冷凍干燥的凍干粉低溫可放置幾十年。
